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實(shí)時(shí)熒光定量PCR常見問題及注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間： 2020-12-29
常見問題分析
1. 做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候，可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內(nèi)參和目的基因？
建議最好用同樣稀釋倍數(shù)做曲線，因?yàn)槟０鍧舛葧绊憯U(kuò)增效率。
2. 熔解曲線中，Tm不出現(xiàn)在80度左右？
擴(kuò)增片段100bp左右的，一般應(yīng)該出現(xiàn)在80度左右。如果低于此溫度出現(xiàn)，可能是模板降解。
3. 擴(kuò)增曲線沒有Ct值，僅僅一條斜線？什么原因？
模板濃度過低或者模板降解。
4. 如果內(nèi)參和目標(biāo)基因表達(dá)量差別比較大，也就是目的基因的表達(dá)量少，
Ctcon=15，Cttarget=38，可否應(yīng)用？
可以用于數(shù)據(jù)分析。因?yàn)楸磉_(dá)量低，從而用過高模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而同內(nèi)標(biāo)的模板不同，反而會增大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的誤差。
5. 引物濃度可否是50nM，是否太低？
如果擴(kuò)增曲線和熔解曲線比較好，這個濃度當(dāng)然可以。如果更低，擴(kuò)增結(jié)果好的情況下，同樣可以運(yùn)用。
一句話，所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的，會影響擴(kuò)增效率。
6. miRNA多個擴(kuò)增時(shí)候，如果一個的擴(kuò)增效果比較，其它熔解曲線不止一個峰，如何解決？
Primer對于miRNA是專一的。所以重新設(shè)計(jì)引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應(yīng)體系會影響反應(yīng)產(chǎn)物的。
7. 相對定量方法，如果用Ct值比較，是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好？
相對定量的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，主要取決于實(shí)驗(yàn)的目的和材料的準(zhǔn)備。如果是材料群體個體差異不大，這2種方法基本沒有很大的區(qū)別；如果是個體差異比較大，建議用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線做。就是分別做內(nèi)參和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別帶入Ct值計(jì)算。
8. 熔解程序可否不加？
如果是擴(kuò)增效果好，特異擴(kuò)增，可以不加熔解程序；但建議做好加上。
9. 擴(kuò)增反應(yīng)體系5uL，擴(kuò)增效率低，什么原因？
反應(yīng)體系小，各種因素的影響比較大，比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴(kuò)增效率的。
10. 如何減少非特異性擴(kuò)增的干擾？
設(shè)計(jì)一對好引物，提高primer的退火溫度，以及設(shè)定吸光溫度。
其他注意事項(xiàng)： 按照正確的開關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機(jī)順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。 2. 應(yīng)該定期備份您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤刻錄。同時(shí)您也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 3. 良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面： 電源：推薦配備合適的UPS或穩(wěn)壓器。 通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒有阻擋。 溫度：推薦實(shí)驗(yàn)室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在10-30°C之間。 濕度：20-80%；對于潮濕的省份，推薦實(shí)驗(yàn)室配備除濕機(jī)。 空間：易于操作，安全。 4. 怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染 一個辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個或多個反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個孔的信號明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。 清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應(yīng)孔中。 吹打數(shù)次。 將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。
